多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对体外培养的视网膜色素上皮细胞磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的调控作用

摘要：目的：观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对体外培养的视网膜色素上皮(RPE)细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路的调控作用。方法将体外培养的 RPE 细胞分为 PSF 高表达组、PSF 高表达对照组、PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组。应用脂质体2000将上调 PSF 表达的真核质粒增强型绿色荧光蛋白(pEGFP)-C2-PSF、下调 PSF 表达的真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 以0.25、0.50、1.00μg 的递增量分别转染至 PSF 高表达组及 PSF 低表达组细胞。PSF 高表达对照组细胞转染 pEGFP-C2空载质粒。PSF 低表达对照组细胞转染 pGenesil-scramble-siRNA 质粒。假转染组仅做转染处理,不加入任何表达质粒。采用水溶性四氮唑法检测胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激条件下 PSF 对 RPE 细胞增生的影响。应用脂质体2000将0.50μg 真核质粒pEGFP-C2-PSF、1.00μg 真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 及 pEGFP-C2空载质粒转染细胞分别作为 PSF 高表达组、PSF 低表达组、对照组,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测 PSF 对 IGF-1诱导的 RPE 细胞内血管内皮生长因子(VEGF)mRNA 表达的影响。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测 PSF 对 IGF-1诱导的磷酸化 Akt (pAkt)蛋白表达的影响。在 IGF-1刺激后,将 RPE 细胞分为单纯渥曼青霉素(Wortmannin)处理组、单纯 PSF 高表达组、渥曼青霉素联合 PSF 高表达处理组,并以未经渥曼青霉素处理的常规体外培养的 RPE 细胞为对照组,采用实时定量 PCR 检测各组 VEGF 的表达。结果IGF-1刺激后,PSF 高表达组、PSF 高表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义(F =29.728,P <0.05)；PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义(F =14.121,P <0.05)。PSF 高表达组 RPE 细胞中 VEGF mRNA 表达较对照组明显降低,差异有统计学意义(P =0.0003)；PSF 低表达组 RPE 细胞中 VEGF mRNA 表达较对照组明显提高,差异有统计学意义(P =0.0309)。Western blot 检测结果显示,IGF-1刺激可上调 pAkt 蛋白表达水平,PSF 高表达可明显下调 pAkt 蛋白表达水平。IGF-1刺激后,渥曼青霉素联合 PSF 高表达处理组 VEGF 表达较单纯渥曼青霉素处理组明显降低,差异有统计学意义(P <0.05)。结论PSF 能抑制 IGF-1刺激后体外培养的 RPE细胞中 PI3K/Akt 信号通路活化,下调 VEGF 表达。